novaĵoj

Polimeraza ĉena reago (PCR)

AP.BIO:

IST‑1 (EU)

,

IST‑1.P (LO)

,

IST‑1.P.1 (EK)

Tekniko uzata por plifortigi aŭ fari multajn kopiojn de specifa celregiono de DNA.

 

Esencaj punktoj:

  • Polimeraza ĉena reago, aŭ PCR, estas tekniko por fari multajn kopiojn de specifa DNA-regiono in vitro (en provtubo prefere ol organismo).
  • PCR dependas de termostabila DNA-polimerazo, Taq polimerazo, kaj postulas DNA enkondukoj dizajnita specife por la DNA-regiono de intereso.
  • En PCR, la reago estas plurfoje biciklita tra serio de temperaturŝanĝoj, kiuj permesas multajn kopiojn de la celregiono esti produktitaj.
  • PCR havas multajn esplorojn kaj praktikajn aplikojn. Ĝi estas rutine uzita en DNA-klonado, medicinaj diagnozoj, kaj krimmedicina analizo de DNA.

Kio estas PCR?

Polimeraza ĉena reago (PCR) estas ofta laboratoriotekniko uzata por fari multajn kopiojn (milionojn aŭ miliardojn!) de aparta regiono de DNA. Ĉi tiu DNA-regiono povas esti io ajn, pri kio la eksperimentanto interesiĝas. Ekzemple, ĝi povus esti geno, kies funkcion esploristo volas kompreni, aŭ genetika markilo uzata de krimmedicinaj sciencistoj por kongrui DNA de krimloko kun suspektatoj.

Tipe, la celo de PCR estas fari sufiĉen de la cela DNA-regiono ke ĝi povas esti analizita aŭ uzita alimaniere. Ekzemple, DNA plifortigita per PCR povas esti sendita por sekvencado, bildigita per ĝela elektroforezo, aŭ klonita en plasmidon por pliaj eksperimentoj.

PCR estas uzita en multaj lokoj de biologio kaj medicino, inkluzive de molekula biologia esplorado, medicina diagnozo, kaj eĉ kelkaj branĉoj de ekologio.

Taq polimerazo

Ŝati DNA-reproduktado en organismo, PCR postulas DNA-polimerazenzimon kiu faras novajn fadenojn de DNA, utiligante ekzistantajn fadenojn kiel ŝablonojn. La DNA-polimerazo tipe uzita en PCR estas nomita Taq polimerazo, post la varmotolerema bakterio de kiu ĝi estis izolita (Thermus aquaticus).

T. aquaticus vivas en termofontoj kaj hidrotermikaj ellastruoj. Ĝia DNA-polimerazo estas tre varmstabila kaj estas plej aktiva ĉirkaŭ 70 °\text C70°C70, °, startteksto, C, finteksto (temperaturo ĉe kiu homo aŭ E. coli DNA-polimerazo estus nefunkcia). Ĉi tiu varmostabileco igas Taq-polimerazon ideala por PCR. Kiel ni vidos, alta temperaturo estas uzata plurfoje en PCR al denaturigi la ŝablono DNA, aŭ apartigi ĝiajn fadenojn.

PCR-enkondukoj

Kiel aliaj DNA-polimerazoj, Taq polimerazo povas fari DNA nur se ĝi ricevas a primer, mallonga sekvenco de nukleotidoj kiu disponigas deirpunkton por DNA-sintezo. En PCR-reago, la eksperimentisto determinas la regionon de DNA kiu estos kopiita, aŭ plifortigita, per la enkondukoj kiujn ŝi aŭ li elektas.

PCR-enkondukoj estas mallongaj pecoj de unu-fadena DNA, kutime proksimume 202020 nukleotidoj en longo. Du enkondukoj estas uzitaj en ĉiu PCR-reago, kaj ili estas dizajnitaj tiel ke ili laŭflankas la celregionon (regiono kiu devus esti kopiita). Tio estas, ili ricevas sekvencojn kiuj igos ilin ligi al kontraŭaj fadenoj de la ŝablono DNA, ĵus ĉe la randoj de la regiono por esti kopiita. La enkondukoj ligas al la ŝablono per komplementa bazpariĝo.

Ŝablono DNA:

5′ TATCAGATCCATGGAGT…GAGTACTAGTCCTATGAGT 3′ 3′ ATAGTCTAGGTACCTCA…CTCATGATCAGGATACTCA 5′

Enkonduko 1: 5′ CAGATCCATGG 3′ Enkonduko 2:

Kiam la enkondukoj estas ligitaj al la ŝablono, ili povas esti etenditaj per la polimerazo, kaj la regiono kiu kuŝas inter ili estos kopiita.

[Pli detala diagramo montranta DNA kaj unuadirekcon]

La paŝoj de PCR

La ĉefaj ingrediencoj de PCR-reago estas Taq polimerazo, enkondukoj, ŝablono DNA, kaj nukleotidoj (DNA konstrubriketoj). La ingrediencoj estas kunvenitaj en tubo, kune kun kofaktoroj bezonitaj per la enzimo, kaj estas submetitaj tra ripetaj cikloj de hejtado kaj malvarmigo kiuj permesas al DNA esti sintezita.

La bazaj paŝoj estas:

  1. Denaturado (96 °\text C96°C96, °, starttext, C, end text): Varmigu la reagon forte por apartigi, aŭ malnaturacii, la DNA-fadenojn. Ĉi tio provizas unu-fadenan ŝablonon por la sekva paŝo.
  2. Kolekti (555555 - 656565°\text C°C°, startteksto, C, finteksto): Malvarmu la reagon tiel la enkondukoj povas ligi al siaj komplementaj sekvencoj sur la unufadena ŝablon DNA.
  3. Etendo (72 °\text C72°C72, °, starttext, C, end text): Altigu la reagtemperaturojn tiel Taq polimerazo etendas la enkondukojn, sintezante novajn fadenojn de DNA.

Ĉi tiu ciklo ripetas 252525 - 353535 fojojn en tipa PCR-reago, kiu ĝenerale daŭras 222 - 444 horojn, depende de la longo de la DNA-regiono kopiita. Se la reago estas efika (bone funkcias), la cela regiono povas iri de nur unu aŭ kelkaj kopioj al miliardoj.

Tio estas ĉar ne nur la originala DNA estas uzata kiel ŝablono ĉiufoje. Anstataŭe, la nova DNA, kiu estas farita en unu raŭndo, povas servi kiel ŝablono en la sekva raŭndo de DNA-sintezo. Estas multaj kopioj de la enkondukoj kaj multaj molekuloj de Taq polimerazo flosanta ĉirkaŭe en la reago, do la nombro da DNA-molekuloj povas proksimume duobliĝi en ĉiu rondo de biciklado. Ĉi tiu ŝablono de eksponenta kresko estas montrita en la bildo sube.

Uzante ĝelelektroforezon por bildigi la rezultojn de PCR

La rezultoj de PCR-reago estas kutime bildigitaj (videblaj) uzante ĝela elektroforezoĜela elektroforezo estas tekniko en kiu fragmentoj de DNA estas tiritaj tra ĝela matrico per elektra kurento, kaj ĝi apartigas DNA-fragmentojn laŭ grandeco. Normo, aŭ DNA-ŝtupetaro, estas tipe inkludita tiel ke la grandeco de la fragmentoj en la PCR-provaĵo povas esti determinita.

DNA-fragmentoj de la sama longo formas "grupon" sur la ĝelo, kiu povas esti vidita per okulo se la ĝelo estas makulita per DNA-liga tinkturfarbo. Ekzemple, PCR-reago produktanta 400400400 bazpar-fragmenton (bp) aspektus tiel sur ĝelo:

Maldekstra leno: DNA-ŝtupetaro kun 100, 200, 300, 400, 500 bp-bendoj.

Dekstra leno: rezulto de PCR-reago, grupo ĉe 400 bp.

DNA-grupo enhavas multajn, multajn kopiojn de la cela DNA-regiono, ne nur unu aŭ kelkajn kopiojn. Ĉar DNA estas mikroskopa, multaj kopioj de ĝi devas ĉeesti antaŭ ol ni povas vidi ĝin okule. Ĉi tio estas granda parto de kial PCR estas grava ilo: ĝi produktas sufiĉe da kopioj de DNA-sekvenco ke ni povas vidi aŭ manipuli tiun regionon de DNA.

Aplikoj de PCR

Uzante PCR, DNA-sekvenco povas esti plifortigita milionoj aŭ miliardoj da tempoj, produktante sufiĉe da DNA-kopioj por esti analizita uzante aliajn teknikojn. Ekzemple, la DNA povas esti bildigita per ĝelelektroforezo, sendita por sekvencado, aŭ digestita kun restriktaj enzimoj kaj klonita en plasmidon.

PCR estas uzata en multaj esplorlaboratorioj, kaj ĝi ankaŭ havas praktikajn aplikojn en jurmedicino, genetika testado kaj diagnozo. Ekzemple, PCR kutimas plifortigi genojn asociitajn kun genetikaj malsanoj de la DNA de pacientoj (aŭ de feta DNA, kaze de antaŭnaska testado). PCR ankaŭ povas esti uzita por testi por bakterio aŭ DNA-viruso en la korpo de paciento: se la patogeno ĉeestas, povas esti eble plifortigi regionojn de ĝia DNA de sango aŭ histoprovaĵo.

Specimena problemo: PCR en jurmedicino

Supozu, ke vi laboras en jurmedicina laboratorio. Vi ĵus ricevis DNA-provaĵon de haro lasita ĉe krimloko, kune kun DNA-provaĵoj de tri eblaj suspektatoj. Via tasko estas ekzameni apartan genetikan markilon kaj vidi ĉu iu el la tri suspektatoj kongruas kun la hara DNA por ĉi tiu markilo.

La signo venas en du aleloj, aŭ versioj. Unu enhavas ununuran ripeton (bruna regiono malsupre), dum la alia enhavas du kopiojn de la ripeto. En PCR-reago kun enkondukoj kiuj laŭflankas la ripetregionon, la unua alelo produktas 200200200 \text{bp}bpstart-tekston, b, p, fintekston DNA-fragmenton, dum la dua produktas 300300300 \text{bp}bpstart-tekston, b. , p, fina teksto DNA-fragmento:

Signila alelo 1: enkondukoj laŭflankantaj ripetan regionon plifortigas fragmenton de 200 bp de DNA

Marka alelo 2: enkondukoj laŭflankantaj ripetregionon plifortigas 300 bp fragmenton de DNA

Vi faras PCR sur la kvar DNA-provaĵoj kaj bildigas la rezultojn per ĝela elektroforezo, kiel montrite sube:

La ĝelo havas kvin lenojn:

Unua leno: DNA-ŝtupetaro kun 100, 200, 300, 400, kaj 500 bp-bendoj.

Dua leno: DNA de krimloko, 200 bp grupo.

Tria leno: suspektato numero 1 DNA, 300 bp-grupo.

Kvara leno: suspektinda numero 2 DNA, 200 kaj 300 bp-bendoj.

Kvina leno: suspektato numero 3 DNA, 200 bp-grupo.

La DNA de kiu suspektato kongruas kun la DNA de la krimloko ĉe ĉi tiu signo?

Elektu 1 respondon:

Elektu 1 respondon:

(Elekto A)

A

Suspektato 111

(Elekto B)

B

Suspektato 222

(Elekto C)

C

Suspektato 333

(Elekto D)

D

Neniu el la suspektatoj

[Sugesto]

Ni ne povis klasifiki vian respondon. Ŝajnas, ke vi lasis ion malplena aŭ enigis nevalidan respondon.

Kontrolu

Pli pri PCR kaj jurmedicino

En realaj krimmedicinaj testoj de DNA de krimloko, teknikistoj farus analizon koncipe similan al tiu en la supra ekzemplo. Tamen, kelkaj malsamaj signoj (ne nur la ununura signo en la ekzemplo) estus komparitaj inter la krimloko DNA kaj la DNA de la suspektatoj.

Ankaŭ, la markiloj uzitaj en tipa krimmedicina analizo ne venas en nur du malsamaj formoj. Anstataŭe, ili estas altagrade polimorfa (poli = multaj, morfo = formo). Tio estas, ili venas en multaj aleloj kiuj varias en etaj pliigoj de longo.

La plej ofte uzata speco de signoj en jurmedicino, nomita mallongaj tandemaj ripetoj (STRoj), konsistas el multaj ripetaj kopioj de la sama mallonga nukleotidsekvenco (tipe, 222 ĝis 555 nukleotidoj longa). Unu alelo de STR povus havi 202020 ripetojn, dum alia povus havi 181818, kaj alia nur 101010^11start superscript, 1, end superscript.

Ekzamenante multoblajn markilojn, ĉiu el kiuj venas en multaj alelaj formoj, krimmedicinaj sciencistoj povas konstrui unikan genetikan "fingrospuron" el DNA-provaĵo. En tipa STR-analizo uzanta 131313 markilojn, la probableco de falsa pozitivo (du homoj havantaj la saman DNA- "fingrospuron") estas malpli ol 111 en 101010 \text{miliardo}billionstart teksto, b, i, l, l, i, o, n, finteksto^11komenco superskribo, 1, finsuperskribo!

Kvankam ni povas pensi pri DNA-indico uzata por kondamni krimulojn, ĝi ludis decidan rolon en senkulpigo de malvere akuzitaj homoj (inkluzive de iuj, kiuj estis malliberigitaj dum multaj jaroj). Krimmedicina analizo ankaŭ kutimas establi patrecon kaj identigi homajn restaĵojn de katastrofscenoj.

[Atribuo kaj referencoj]

Ĉu vi estas studento aŭ instruisto?

Studentinstruisto

 


Afiŝtempo: Jan-08-2021